miRNA靶基因鉴定
靶基因鉴定是阐明miRNA作用机制的关键,如何预测和验证靶基因是所有miRNA研究工作者面临并需要解决的难题。Geneup公司使用多种在线工具免费为您进行miRNAs靶基因的预测,并结合现有各种基因数据库与miRNAs功能数据库,为您提供最可靠的判断。所有miRNA靶基因的预测结果必须通过各种实验手段进行验证,主要包括:
Ø 靶基因3’ -UTR荧光素酶报告实验;
Ø 蛋白质水平验证miRNA过表达或抑制表达与靶基因蛋白水平的关系。
(一)靶基因3’-UTR荧光素酶报告基因载体
Geneup公司利用两种荧光素酶报告基因检测系统,构建miRNA候选靶基因3`-UTR的载体,通过萤光素酶活性检测,确定miRNA与靶基因3`-UTR的关系。
1.单荧光素酶(F.Luc)报告载体pFLuc载体图谱:
载体特点:
Ø 用SV40启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因(F.Luc)的表达;
Ø 氨苄抗性筛选基因;
Ø 通过EcoRI- XbaI双酶切后插入3’-UTR。
检测原理:
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pSL-UTR质粒和含有海肾萤光素酶报告基因(R.Luc)的内参载体(pRL-con-vector)共转染哺乳动物细胞,然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体,如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降,说明miRNA能特异结合该3`-UTR,该基因可能为miRNA的靶基因。
2、双荧光素酶(F.Luc/R.Luc)报告基因载体:pdLuc
载体图谱:
载体特点:
Ø 用PGK启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因(F.Luc)的表达,同一载体上另一个报告基因是由SV40启动子控制下的海肾萤光素酶-新霉素基因融合蛋白基因(R.luc-Neo),用于归一化处理和阳性筛选;
Ø 可以用G418进行稳转细胞的筛选;
Ø 3`-UTR多克隆位点是EcoRI-XhoI
检测原理:
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pdLuc-UTR质粒共转染哺乳动物细胞,然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体,如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降,说明miRNA能特异结合该3’-UTR,该基因可能为miRNA的靶基因。
(二) 靶基因UTR产品及服务列表
服务项目:
² 靶基因3’-UTR载体构建:请提供靶基因的名称(GenBank Accession no.),需要克隆的靶基因UTR的范围(大小在0.5 kb以内最为理想,建议不要超过1 kb);选择待克隆的载体。
² 3’-UTR实验分析:分析3’-UTR报告基因活性,鉴定miRNA的靶基因;miRNA过表达质粒可由客户提供或由Geneup公司构建。
3’-UTR突变分析:分析3’-UTR-mut报告基因活性,进一步鉴定miRNA的靶基因。服务流程:
² PCR扩增靶基因的3’-UTR,或直接合成结合位点序列;
² 将上述DNA片段克隆至报告载体,并测序;
² 构建3’-UTR突变载体,并测序;
² 构建miRNA 表达载体;
² 将3’-UTR报告载体(或突变载体)与miRNA过表达载体(或对照载体)共转染细胞;
² 双荧光素酶表达水平测定。
服务内容 |
服务周期 |
3’-UTR荧光素酶报告载体构建服务 |
20个工作日 |
3’-UTR突变荧光素酶报告载体构建服务 |
20个工作日 |
3’-UTR荧光素酶报告基因检测服务 |
20个工作日 |
3’-UTR突变荧光素酶报告基因检测服务 |
20个工作日 |
Western blot检测服务 |
30个工作日 |
注:3’-UTR序列长度应<1Kb,随着构建序列长度越长,构建难度加大,价格相应增加。