靶基因3’-UTR荧光素酶报告基因载体
Geneup公司利用两种荧光素酶报告基因检测系统，构建miRNA候选靶基因3`-UTR的载体，通过萤光素酶活性检测，确定miRNA与靶基因3`-UTR的关系。
1.单荧光素酶(F.Luc)报告载体pFLuc载体图谱：
载体特点：
Ø 用SV40启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因（F.Luc）的表达；
Ø 氨苄抗性筛选基因；
Ø 通过EcoRI- XbaI双酶切后插入3’-UTR。
检测原理：
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pSL-UTR质粒和含有海肾萤光素酶报告基因（R.Luc）的内参载体（pRL-con-vector）共转染哺乳动物细胞，然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体，如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降，说明miRNA能特异结合该3`-UTR，该基因可能为miRNA的靶基因。
2、双荧光素酶(F.Luc/R.Luc)报告基因载体：pdLuc 载体图谱： 载体特点： Ø 用PGK启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因（F.Luc）的表达，同一载体上另一个报告基因是由SV40启动子控制下的海肾萤光素酶-新霉素基因融合蛋白基因（R.luc-Neo），用于归一化处理和阳性筛选； Ø 可以用G418进行稳转细胞的筛选； Ø 3`-UTR多克隆位点是EcoRI-XhoI 检测原理： 将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pdLuc-UTR质粒共转染哺乳动物细胞，然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体，如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降，说明miRNA能特异结合该3’-UTR，该基因可能为miRNA的靶基因。 ² 靶基因3’-UTR载体构建：请提供靶基因的名称(GenBank Accession no.)，需要克隆的靶基因UTR的范围（大小在0.5 kb以内最为理想，建议不要超过1 kb）；选择待克隆的载体。 ² 3’-UTR实验分析：分析3’-UTR报告基因活性，鉴定miRNA的靶基因；miRNA过表达质粒可由客户提供或由Geneup公司构建。 ² 3’-UTR突变分析：分析3’-UTR-mut报告基因活性，进一步鉴定miRNA的靶基因。
